Функции и инструменты платформы

Частота терминов

Исследователи могут видеть частоту поисковых запросов в наборах контента, чтобы начать определять основные темы и оценивать, как люди, места, события и идеи взаимодействуют и развиваются во времени.

Средство поиска тем

Путем группировки часто встречающихся тем этот инструмент выявляет скрытые связи в поисковых запросах, помогая формировать исследования путем интеграции разнообразного контента с релевантной информацией.

Возможность перекрестного поиска

Поиск по содержимому дополнительных продуктов из первоисточников, включая книги, в единой интуитивно понятной среде, обеспечивающей новые инновационные исследовательские связи.

World of Microbes Часть 3: Производство антител с помощью микробов

Когда вы думаете о микробах, что приходит вам на ум? Заплесневелый хлеб, пенициллин и антибиотики? Вакцина? Ферментированные продукты, такие как йогурт и чайный гриб? И последнее увлечение пробиотиками для здоровья? Как насчет выработки антител для иммунной терапии? Может быть, не так много, но вы должны знать, что использование микробов широко и постоянно растет. Теперь исследователи находят способы использовать микробы для производства терапевтических продуктов.

В этой серии «Мир микробов» я рассмотрел некоторые аспекты использования микробов. Включая антибиотики и вакцины, а также дивный новый мир кишечной флоры. Но это ни в коем случае не конец полезности микробов.

Сегодня я расскажу вам о выработке антител и микробах.

Обновление антител

В основном типе иммунотерапии используются антитела, те сложные белки, которые распознают и связывают почти бесконечное количество антигенов. Из-за этого они широко используются в качестве диагностических и лабораторных инструментов. Существуют даже специализированные компании по производству моноклональных антител in vitro.

Структура антител — один из ключей к их успеху. Они содержат вариабельную область (Fv), специально предназначенную для связывания определенного антигена, и константную область (Fc), которая связывает рецептор (показанный на рисунке 1). Эффекторные клетки имеют рецепторы, которые распознают Fc-участок антитела, помещая их в непосредственной близости от Fv-участка, связанного с его антигеном. Это запускает каскад событий, вызывающих поиск и уничтожение антигена по всему телу.

Рисунок 1: Структура антитела

В терапии моноклональными антителами используются некоторые или все части антител. Используемые части зависят от желаемого терапевтического эффекта и возможности изготовления части до уровня чистоты и однородности, приемлемого для использования в качестве лекарства. Вы можете прочитать большое резюме различных типов фрагментов антител в Expression of Recombinant Antibodies. Но, какие бы части вы ни решили использовать, вам нужно сначала их изготовить.

Микробы для иммунотерапии

В настоящее время наиболее распространенным методом производства антител является использование эукариотических клеток яичника китайского хомячка (СНО). Однако это дорогостоящий и трудоемкий производственный метод, поэтому были предприняты попытки экспрессировать их в микробах. По данным Robinson et al. в настоящее время существует 151 иммунотерапевтический препарат на основе антител. Но только два из них производятся у прокариот.

Это связано с тем, что у прокариот сложно производить комплексные антитела. Другой большой проблемой использования прокариот для производства моноклональных антител является безопасность микробных продуктов для использования человеком. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) даже публикует специальный свод правил под названием GRAS — Общепризнанные безопасные — которые обеспечивают безопасность микробных продуктов и производство моноклональных антител для человека.

Хотя это еще не очень успешно, давайте посмотрим на микробы, которые ДЕЙСТВИТЕЛЬНО работают над созданием антител и фрагментов антител.

Производство прокариотических антител

Прокариоты в основном используются для получения фрагментов антител, наиболее популярными из которых являются фрагменты Fab и scFv (рис. 1).

Грамотрицательные бактерии

В грамотрицательных бактериях, таких как наш всегда популярный друг E. coli , есть два компартмента для экспрессии белка – цитоплазма и периплазматическое пространство, которое представляет собой область между двумя клеточными мембранами. Первые E. coli была успешной секреция Fv- и Fab-фрагментов в периплазму, где окислительная среда позволяла правильно формировать дисульфидные связи. Фрагменты также продуцируются в цитоплазме путем конструирования хелперов, которые обеспечивают правильную укладку белка [1]. Низкий выход белка преодолевается за счет использования систем ферментации в реакторе (где питательные вещества постоянно добавляются, а отходы удаляются), а не традиционной закрытой системы шейкерной колбы.

Полноразмерные антитела также могут быть получены в бактериях [1-3], и это даже делается в коммерческих целях в Кишечная палочка.  Опубликованные процессы основаны на секреции антител в периплазму, где происходит свертывание. Это проблема, потому что объем периплазмы мал и ограничивает выход, а также потому, что в периплазме отсутствуют шапероны, помогающие фолдингу белка [2]. Попытки продуцировать антитела в цитоплазме были безуспешными до недавнего времени [2], когда полноразмерные IgG-антитела были экспрессированы в E. coli на уровнях, сходных с таковыми в системе CHO. Тем не менее, существует еще ряд проблем, которые необходимо решить, прежде чем эту систему можно будет использовать эффективно.

Грамположительные бактерии

Грамположительные бактерии также вырабатывают антитела. Одним из преимуществ грамположительных бактерий является то, что они не продуцируют эндотоксин — высокоиммуногенный липополисахарид, продуцируемый грамотрицательными бактериями, вызывает септический шок. ЛПС должен быть удален, чтобы продукт антитела считался терапевтическим и достигал статуса GRAS. Фрагмент scFv против бактерий кариеса Streptococcus mutans , продуцируемых грамположительными Lactobacilli показал эффективность на крысиной модели кариеса зубов [4].

Производство дрожжевых антител

Низшие эукариоты также использовались для производства антител. Они имеют то преимущество перед прокариотами, что они больше напоминают систему экспрессии белков млекопитающих, что позволяет легче экспрессировать и укладывать сложные белки. Кроме того, они не производят эндотоксины, как грамотрицательные бактерии.

Из дрожжей, Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae доминируют в области производства антител. S. cerevisiae имеет то преимущество, что он очень хорошо охарактеризован. Однако при производстве фрагментов антител правильная укладка и низкие выходы могут быть проблемой. S. cerevisiae также секретирует свои собственные эндогенные белки, которые необходимо удалять из любого препарата антител [5, 6].

Pichia pastoris, , с другой стороны, не секретирует высокий уровень собственного белка. Он также вырастает до высокой плотности клеток и уникален своей способностью расти, используя метанол в качестве единственного источника углерода. Эта характеристика полезна, потому что присутствие и отсутствие метанола строго контролирует промотор, который можно использовать для эффективного и строгого включения и выключения экспрессии рекомбинантного белка. Однако метанол выше определенного уровня токсичен, и метанол трудно использовать из-за его летучести; альтернативные промоторы находятся в стадии изучения [5, 7]. Еще одним преимуществом Pichia является способность гуманизировать систему добавления углеводов (гликозилирования). Гликозилирование дрожжей и человека значительно различается, но Pichia pastoris может быть сконструирован для стимулирования большего количества паттернов гликозилирования у человека, и этому уделяется значительное внимание [6].

Производство антител в грибах

Помимо дрожжей, мицелиальные грибы, такие как Trichoderma и Aspergillus, которые в настоящее время широко используются для производства белков в пищевой и биотехнологической промышленности, также используются для получения фрагментов антител и полноразмерных антител при высоких концентрациях. урожаи. Однако правильный фолдинг антитела (полной длины и фрагментов) остается проблемой [8].

Таким образом, несмотря на то, что в отделе полной длины все еще есть некоторые сомнения, как прокариотические, так и эукариотические микробы успешно исследуются и используются в качестве более дешевых источников антител. Это благо не только для лабораторной диагностики, но и для здоровья и благополучия человека.

Ссылки

1. Frenzel, A., M. Hust, and T. Schirrmann, Экспрессия рекомбинантных антител. Границы иммунологии, 2013. 4: с. 217.

2. Робинсон, М.-П., Н. Ке, Дж. Лобштейн, К. Петерсон, А. Шкодны, Т.Дж. Мэнселл, К. Таки, П.Д. Риггс, П.А. Колусси, С.Дж. Норен, С.Х. Тарон, член парламента ДеЛиза и М. Беркмен, Эффективная экспрессия полноразмерных антител в цитоплазме сконструированных бактерий. Нацкоммуна, 2015. С. 6. 9.0009

3. Сидху, С.С., Полноразмерные антитела на выставке. Nat Biotech, 2007. 25(5): с. 537-538.

4. Крюгер, К., Ю. Ху, К. Пан, Х. Маркотт, А. Халтберг, Д. Дельвар, П. Дж. ван Дален, П.Х. Пауэлс, Р.Дж. Леер, К.Г. Келли, К. ван Долленвирд, Дж.К. Ма и Л. Хаммарстром, Обеспечение пассивного иммунитета in situ лактобациллами, продуцирующими одноцепочечные антитела. Nat Biotech, 2002. 20(7): с. 702-706.

5. Дарби, Р.А.Дж., С.П. Картрайт, М.